ストレプトゾトシンはp53シグナル伝達の活性化を介して腎近位尿細管損傷を誘発する

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8705 (2023) この記事を引用

212 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ストレプトゾトシン (STZ) は、主に臨床現場で神経内分泌腫瘍 (NET) の治療に使用される抗がん剤で、グルコーストランスポーター GLUT2 を介して膵臓 β 細胞または近位尿細管上皮細胞に取り込まれます。しかし、腎臓細胞に対するその細胞毒性効果は過小評価されており、根本的なメカニズムは不明のままです。我々は本明細書において、DNA損傷とその後のp53シグナル伝達がSTZ誘発性尿細管上皮損傷の発症に関与していることを実証した。 STZで治療されたNET患者において尿細管上皮DNA損傷が検出されました。インビトロでの STZ 処理尿細管上皮細胞の不偏トランスクリプトミクスにより、p53 シグナル伝達経路の活性化が示されました。 STZ は DNA 損傷を誘導し、in vivo で用量依存的に p53 シグナル伝達を活性化し、その結果、膜トランスポーターが減少しました。 p53 およびナトリウムグルコーストランスポーター 2 (SGLT2) の薬理学的阻害により、STZ 誘発上皮損傷が軽減されました。しかし、膵臓β細胞に対する STZ の細胞毒性効果は、SGLT2 阻害剤で治療したマウスでは保存されていました。本結果は、STZ の近位尿細管特異的細胞毒性と in vivo での基礎となる機構を実証します。 β細胞に対するSTZの細胞毒性効果はダパグリフロジンによって損なわれないため、SGLT2阻害剤による前治療は、STZで治療を受けたNET患者の腎損傷の予防療法としての可能性を秘めています。

グルコース類似体であるストレプトゾシン/ストレプトゾトシン (STZ) は、アルキル化剤の抗がん剤として分類され、主に神経内分泌腫瘍 (NET) の治療に使用される細胞傷害性薬剤の主要なクラスの 1 つです 1,2。 STZ は、グルコーストランスポーター 2 型 (GLUT2) を介して膵臓 β 細胞に取り込まれ、それによって DNA 損傷、活性酸素種 (ROS) 産生、ミトコンドリア機能不全、およびその後のアポトーシスを促進します 3,4,5。臨床試験の結果に基づいて、STZ と 5-フルオロウラシルの組み合わせは、高分化型 NET の患者の治療に一般的に使用されています 6,7。

肝臓と腎臓では GLUT2 が高発現しているため、これらの臓器では STZ の一般的な副作用が発生します 2,8。腎機能障害に加えて、STZ9 で治療された患者では低リン血症や腎性血糖が発生することがあります。非糖尿病性血糖または高リン酸尿症による低リン酸血症は、それぞれ、主に近位尿細管上皮細胞の頂端膜で発現されるナトリウム-グルコーストランスポーターまたはナトリウム-リン酸共トランスポーターの減少によって引き起こされます。刷子縁膜トランスポーターの喪失または減少は急性腎障害の初期反応であるため 10、11、12、13、STZ 治療後の血糖または低リン血症は潜在的な近位尿細管損傷を反映している可能性がありますが、これは臨床現場では過小評価または無視されています。

実験分野では、STZ は膵臓 β 細胞を破壊する糖尿病誘発剤として一般的に使用され、その結果 1 型糖尿病の発症を引き起こします 14,15。しかし、STZ 誘発 1 型糖尿病マウスの腎臓表現型の解析において、潜在的な懸念の 1 つは、STZ14、15、16 の投与によって誘発される腎毒性です。もう 1 つの懸念は、STZ に対する感受性がげっ歯類の種類や遺伝的背景によって異なることです 15。したがって、STZ の投与量または投与スケジュールを最適化することで、その腎毒性を防ぐことができる可能性があります 15。しかし、STZ誘発1型糖尿病マウスの腎臓の表現型が高血糖に起因するのか、それともSTZ16による直接的な細胞毒性に起因するのかを確立することは困難である。

NET を治療するための STZ の使用の増加を考慮すると、STZ による腎毒性の根底にあるメカニズムをより詳細に理解することが、その悪影響を防ぐために不可欠です。 STZ 誘発性腎毒性に関する実験結果はすでに報告されていますが 16、17、18、19 ですが、根底にある分子機構は不明のままです。本研究では、DNA損傷とその後のp53シグナル伝達に焦点を当てて、STZ処理した尿細管上皮細胞に対してin vitroおよびin vivo実験で公平なトランスクリプトミクスを実施しました。

まず、当施設で STZ 治療を受けた 8 人の NET 患者の腎臓の表現型を調べました。平均年齢と血清クレアチンレベルは、それぞれ62.0±10.9歳と0.87±0.12mg/dlでした（補足表1）。 1 人の患者は、膵臓腫瘍の外科的切除により STZ 治療後に糖尿病を発症しました。採尿時の血糖値と比較すると、患者 8 人中 7 人が不十分な尿中血糖値陽性を示しました。患者 7 人中 5 人および患者 7 人中 6 人は、それぞれ低血清リンおよび低尿酸レベルを示しました (補足表 1)。 2人の患者で腎臓の組織学が評価されました。 PAS およびマッソントリクローム染色では、刷子縁の喪失と扁平な尿細管上皮細胞を特徴とする中等度の間質線維症および尿細管損傷が示されました (図 1)。 DNA損傷はSTZによって誘発される細胞傷害作用の中でも主要な病態生理の1つであるため、DNA損傷のマーカーであるγH2AXの免疫染色を実施しました。 γH2AX 染色により、患者の尿細管上皮細胞の核染色が陽性であることが明らかになりましたが、損傷を受けていない対照ではそうではありませんでした (図 1)。

STZで治療した神経内分泌腫瘍（NET）患者の尿細管上皮細胞におけるDNA損傷。 γH2AX の免疫染色、PAS およびマッソントリクローム染色を行ったヒト腎生検サンプルの顕微鏡画像。 γH2AX + 尿細管上皮の数を、健常対照としての基底膜薄膜疾患患者 3 名と STZ 治療を受けた NET 患者 2 名 (#1 および #2) の高倍率写真でカウントしました。データは平均値 ± SD です。バー = 50 μm。

NRK52E細胞におけるSTZに対する細胞傷害性応答を調べたところ、STZが用量依存的に細胞生存率を低下させることがわかりました（図2a）。 qPCRにより、STZは近位尿細管損傷マーカーHavcr1（Kim-1をコードする）の発現を増加させなかったが、いくつかの成熟尿細管上皮マーカーSlc34a1およびLrp2（それぞれNaPi2aおよびメガリンをコードした）の発現をわずかに減少させたことが明らかになった（図2b）。 STZの細胞毒性に関与する細胞シグナル伝達を同定するために、10 mMのSTZまたはビヒクルで24時間処理したNRK52E細胞間のトランスクリプトームの違いをRNA配列によって調査しました。遺伝子発現の教師なし分析により、18,930個の遺伝子のうち266個が2つのグループ間で差次的な発現を示したことが明らかになりました（誤検出率補正p値<0.05、絶対倍率変化>2）（図2c）。

STZ処理した尿細管上皮細胞におけるp53シグナル伝達の上方制御。 (a) 生存可能なNRK-52E細胞の数は、STZ処理の24時間後に用量依存的に減少しました。 (b) 損傷した尿細管と健康な尿細管の代表的なマーカーの RNA の qPCR。 (c) STZ 処理した NRK-52E 細胞の RNA 配列。強調表示された遺伝子は、p53 シグナル伝達経路に含まれる発現差が顕著に異なる遺伝子です。（ d ）未処理細胞と STZ 処理細胞の間で差次的に発現された遺伝子の KEGG 経路の濃縮分析。有意に濃縮された上位 10 の KEGG 経路が表示されます。（ e ）γH2AX、ホスホ-p53、切断型カスパーゼ-3、およびGAPDHについてのNRK-52E細胞からのタンパク質溶解物のウェスタンブロット。 n = 3 の代表的な画像。(f) γH2AX、リン酸 p53、および切断されたカスパーゼ 3 バンドの光学密度は、GAPDH の光学密度に対して正規化されました。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。 (b) では対応のない t 検定を使用して統計分析を実行し、(f) では多重比較にダネットの事後検定を使用しました。 * p < 0.05。

京都遺伝子およびゲノム百科事典（KEGG）経路を使用して遺伝子発現に注釈を付け、12の有意に豊富な経路を特定しました（閾値p値<0.05）（図2d）。 p53シグナル伝達経路は、STZ処理細胞で最も高度に上方制御されました（図2d、補足図1）。細胞溶解物のウェスタンブロッティングにより、STZが用量依存的にγH2AX発現とp53リン酸化を上方制御することが明らかになりました（図2e、f）。

STZ が in vivo で尿細管損傷を誘発するかどうかを調べるために、さまざまな濃度の STZ をマウスに注射しました。 STZ注射の24時間後、高用量のSTZで治療したマウスでは血糖値が低下し（図3a）、血漿インスリンレベルが増加しました（図3b）。これは膵臓β細胞死の結果としてのインスリン放出を反映しています。。血清BUNは実験グループ間で差がありませんでしたが（図3c）、STZを単回注射したマウスの腎臓は、刷子縁の喪失を特徴とする尿細管損傷を示しました。これは、高濃度のSTZで治療されたマウスでより重篤でした。 STZの用量（図3d）。全腎臓RNAのqPCRにより、STZ処理マウスにおける成熟尿細管上皮マーカーSlc5a2（SGLT2をコードする）の発現の減少、およびHavcr1の発現の増加が明らかになった（図3e）。また、STZ処理マウスにおけるメガリンの免疫染色の減少も確認しました（図3d）。

インビボでのSTZによる用量依存的な尿細管損傷。 (a) 200 mg/kg の STZ で治療したマウスの血糖値の低下。 (b) 血漿インスリンレベルは、高用量の STZ 治療グループでより高かった。 (c) BUN レベルは実験グループ間で差がありませんでした。（ d ）PAS染色およびメガリンの免疫染色による腎臓組織の顕微鏡画像は、STZ処理マウスにおける刷子縁の喪失を伴う尿細管の増加とメガリン発現の減少を示しました。（ e ）損傷した尿細管と健康な尿細管（頂端膜ナトリウムトランスポーター）の代表的なマーカーに関する腎臓組織からのRNAのqPCR。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 N = 1 グループあたり 5 ～ 7 匹のマウス。 * p < 0.05、(c) の Bar = 50 μm。

我々は、尿細管上皮 DNA 損傷とその後の p53 活性化を in vivo で調べました。 γH2AXの免疫染色により、高用量のSTZで処理したマウスの腎臓組織で陽性の核染色が明らかになりました（図4a）。陽性染色の局在は腎髄質ではなく腎皮質に限定されていました（図4a、b、補足図2）。近位尿細管マーカーであるロータステトラゴノロバスレクチン (LTL) による免疫蛍光染色では、γH2AX 陽性細胞のほとんどが LTL と共染色されることが示されましたが、集合管マーカーであるドリコスビフロルス凝集素 (DBA) の免疫蛍光染色では、γH2AX 陽性細胞はほとんど存在しないことが示されました。 DBA と共染色しました (図 4c)。これらは、STZ 誘発 DNA 損傷が主に皮質近位尿細管で発生することを示しています。 STZ による DNA 損傷を確認し、腎臓における DNA 損傷の種類を解明するために、腎臓組織全体のコメットアッセイを実施しました。アルカリ性条件下（アルカリ性彗星）の彗星尾モーメントは DNA 二本鎖切断（DSB）と一本鎖切断（SSB）を反映しますが、中性条件下（中性彗星）では DNA DSB20 のみを反映します。 STZ処理マウスの腎臓細胞では、アルカリ彗星尾モーメントが用量依存的に増加しました（図4a、d）。 STZ処理マウスの腎細胞では、中性彗星尾モーメントも用量依存的に増加した。ただし、中性彗星の尾のモーメントでは、これらのグループ間の差は小さくなりました（図4d）。この結果は、DNA DSB および SSB が STZ 投与後に用量依存的に腎臓で発生したことを示唆しています。また、STZ処理マウスの全腎臓溶解物におけるγH2AX発現とp53リン酸化の上方制御が用量依存的に確認されました（図4e、f）。

インビボでの STZ による用量依存的な DNA 損傷。 (a) γH2AX について免疫染色した腎臓の顕微鏡画像、および STZ 処理の 24 時間後にマウスから単離した腎細胞のコメットアッセイの代表的な画像。 (b) 腎臓皮質および髄質における核γH2AX 陽性細胞の個別の定量化。（ c ）STZ処理マウスにおけるγH2AXおよび近位尿細管上皮マーカー（LTL）または集合管マーカー（DBA）の免疫蛍光写真。 (d) 定量分析 (アルカリ性彗星: 各 n = 100、中性彗星: 各 n = 50)。（ e ）γH2AX、ホスホ-p53、およびGAPDHの腎臓組織溶解物のウェスタンブロット。 n = 3の代表的な画像。(f) γH2AXおよびリン酸p53バンドの光学密度は、GAPDHの光学密度に対して正規化されました。 N = 1 グループあたり 5 ～ 7 匹のマウス。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 * p < 0.05、バー = (a) では 50 μm、(c) では 25 μm。

亜急性期における STZ 誘発尿細管損傷を in vivo で評価するために、観察期間を STZ 注射後 7 日間に延長しました（図 5a）。高血糖誘発性尿細管損傷を区別するために、STZを注射したマウスの血糖値を下げるためにインスリングラルギンを投与しました（図5a、b）。 STZ処理マウスでは血漿インスリンレベルがわずかに減少しましたが、統計的有意性はありませんでした（図5c）。血清BUNは実験グループ間で差がありませんでした（図5d）。 STZ 単回注射 (150 mg/kg) の 7 日後、マウスの腎臓は刷子縁の喪失を伴う尿細管損傷を示しました。ただし、インスリンの有無にかかわらず、STZ注射の間に有意差は観察されませんでした（図5e）。 γH2AXの免疫染色により、インスリンの有無にかかわらずSTZで陽性の核染色が明らかになりました（図5e、f）。全腎臓RNAのqPCRにより、STZ処理マウスにおける成熟尿細管上皮マーカー（Slc5a2、Slc34a1、およびLrp2）の発現がわずかに減少し、Havcr1の発現に有意な変化がないことが明らかになりました（図5g）。この結果は、STZ による尿細管損傷が亜急性期の血糖値とは無関係に発生したことを示しています。

STZによる尿細管損傷とは無関係な血糖値。 (a) 実験計画。 STZ (150 mg/kg) 治療の 2 日後、血糖値を制御するためにインスリングラルギンを約 200 mg/dl 投与し、7 日目にマウスを屠殺しました。 (b) STZ で治療したマウスでは血糖値が増加しました。しかし、インスリングラルギンの投与により減少しました。 (c、d) 血漿インスリンレベル (c) と BUN レベル (d) は実験グループ間で差がありませんでした。（ e ）PASで染色し、γH2AXについて免疫染色した腎臓組織の顕微鏡画像は、インスリングラルギンの有無にかかわらず、STZ処理マウスにおける刷子縁の喪失を伴う尿細管と核のγH2AX陽性細胞の増加を示しました。 (f) 腎臓皮質および髄質における核γH2AX陽性細胞の個別の定量化。 (g) 損傷した尿細管と健康な尿細管の代表的なマーカーに関する腎臓組織からの RNA の qPCR。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 N = 1 グループあたり 4 ～ 5 匹のマウス。 * p < 0.05、(e) の Bar = 50 μm。

STZ誘発性尿細管損傷におけるp53シグナル伝達の上方制御に基づいて、ピフィトリン-αによるp53の薬理学的阻害の予防効果を調べました（図6a）。以前の研究では、SGLT2 阻害剤であるフロリジンが STZ 誘発性尿細管損傷を予防することが実証されました 19。したがって、選択的SGLT2阻害剤であるダパグリフロジンの事前投与がSTZ誘発性のDNA損傷とその後の尿細管損傷を阻害するかどうかも調査しました（図6a）。血糖値とBUNレベルは実験グループ間で有意な差はありませんでした（図6b、d）。 STZで治療したマウスでは、血漿インスリンレベルが増加しました（図6c）。腎臓の DNA 損傷も評価しました。 γH2AXの免疫染色により、STZ誘発陽性核染色はダパグリフロジンによって改善されるが、ピフィトリン-αによっては改善されないことが明らかになった（図6e、f）。彗星アッセイは、アルカリ性および中性彗星の尾モーメントの増加がダパグリフロジンによってわずかに減衰することを示しました（図6g、h）。また、STZ によって誘導される γH2AX 発現の上方制御は、ダパグリフロジンによって改善されるが、ピフィトリン α によっては改善されないことも確認しました。対照的に、STZ誘導性のp53リン酸化は、ピフィトリン-αおよびダパグリフロジンによって改善されました（図6i、j）。

p53シグナル伝達とSGLT2の薬理学的阻害は、in vivoでのSTZ誘発性DNA損傷を改善した。 (a) 実験計画。ピフィトリン-αをSTZ(150 mg/kg)と同時に投与した。ダパグリフロジンは STZ の 2 時間前に投与されました。 STZの投与から24時間後にマウスを屠殺した。 N = 1 グループあたり 5 ～ 11 匹のマウス。 (b) 血糖値はすべての実験グループ間で同様でした。 (c) 血漿インスリンレベルは、STZ 治療グループの方が高かった。 (d) BUN レベルは実験グループ間で差がありませんでした。 (e) γH2AX で免疫染色した腎臓組織の顕微鏡画像。 (f) 腎臓皮質および髄質における核γH2AX陽性細胞の個別の定量化。（ g ）マウスから単離された腎臓細胞の彗星アッセイの代表的な画像、および（ h ）定量分析（アルカリ彗星：各 n = 100、中性彗星：各 n = 50）。 (i) γH2AX、ホスホ-p53、および GAPDH の腎臓組織溶解物のウェスタンブロット。 n = 3 の代表的な画像。(j) γH2AX および蛍光体 p53 バンドの光学密度は、GAPDH の光学密度に対して正規化されました。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 * p < 0.05、(e) の Bar = 50 μm。

組織学的分析では、腎臓のPAS染色により、STZ誘発性尿細管損傷がピフィトリン-αおよびダパグリフロジンによって改善されることが実証された(図7a)。メガリンの免疫染色により、ピフィトリン-αおよびダパグリフロジンがSTZ処理マウスにおけるメガリンの発現を保存することが示された(図7a)。 qPCRにより、ピフィトリン-αまたはダパグリフロジンで処理したマウスでは変化しなかった成熟尿細管上皮マーカー（Slc5a2、Slc34a1、およびLrp2）の発現の減少が明らかになりました（図7b）。しかし、STZによるHavcr1の発現増加は、ピフィトリン-αまたはダパグリフロジンで処理したマウスではわずかに減弱した(図7b)。

p53シグナル伝達およびSGLT2の薬理学的阻害は、in vivoでのSTZ誘発性尿細管損傷を改善した。 (a) PAS で染色し、メガリンで免疫染色した腎臓組織の顕微鏡画像。 (b) 損傷した尿細管と健康な尿細管の代表的なマーカー (頂端膜ナトリウム輸送体) についての腎臓組織からの RNA の qPCR。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 N = 1 グループあたり 5 ～ 11 匹のマウス。 * p < 0.05、Bar = PAS 染色の画像では 50 μm、(c) のメガリンの免疫染色の画像では 100 μm。

STZ誘発性腎障害に対するこれらの腎保護薬の将来の臨床応用に関して、我々はSTZとピフィトリンαまたはダパグリフロジンの併用投与が膵島細胞に及ぼす影響を評価した。 γH2AXの免疫染色により、STZで処理したすべての実験グループにおいて島内の核染色が陽性であることが明らかになった(図8a)。 γH2AX + 細胞の割合は、STZ処理グループ間で同様でした（図8b）。この結果は、DNA損傷に対するダパグリフロジンの予防効果が腎臓では観察されたが、SGLT2を発現しない膵臓では観察されなかったことを示している。

STZ は膵島 DNA 損傷を誘発しました。 (a) γH2AX について免疫染色された膵臓の顕微鏡画像。矢印はγH2AX + 核を示します。 (b) 膵島における核γH2AX 陽性細胞の個別の定量。すべてのグループで、データは平均値 ± SEM です。統計分析はダネットの事後検定を使用して実行され、多重比較に使用されました。 N = 1 グループあたり 5 ～ 11 匹のマウス。 * p < 0.05、(a) の Bar = 50 μm。

本研究では、STZ 誘発尿細管損傷の根底にあるメカニズムを in vitro および in vivo で調査しました。トランスクリプトーム解析により、STZ 処理した尿細管上皮細胞では p53 シグナル伝達が活性化されていることが示されました。 STZ は用量依存的に尿細管上皮細胞に DNA 損傷を誘発し、その局在は腎臓皮質内に限定されていました。 SGLT2 と同様に p53 を薬理学的に阻害すると、STZ による尿細管損傷が減少しましたが、膵島細胞に対する STZ の細胞傷害効果は維持されました。さらに、STZ で治療された NET 患者の腎生検サンプルでは尿細管 DNA 損傷が明らかでした。まとめると、これらの結果は、細胞への STZ の侵入の基礎となる機構が近位尿細管上皮細胞と膵臓 β 細胞の間で異なり、これが SGLT2 阻害剤または p53 阻害剤の同時投与による STZ に対する応答の違いに寄与していることを示しています。

我々の in vivo 結果では、血糖とは無関係な膜貫通トランスポーターの喪失を含む、STZ 誘発性尿細管損傷が明らかになりました。近位尿細管損傷の最初の表現型は、細胞極性の喪失、細胞周期の停止、および NaPi2a や SGLT210 などの膜トランスポーターの減少です。一般に、血糖値が近位尿細管の再吸収能力を超えるほど高くなると、糖尿病が現れ始め、健康な非糖尿病対照者の血糖値は通常 250 ～ 300 mg/dl になります 21。私たちのNET患者では、血糖値が血糖の出現を引き起こすほど上昇しているという証拠はなく、尿細管再吸収能力に何らかの異常があることが示唆されています。さらに、糖尿病性腎症に関する以前の所見は、STZ 誘発 1 型糖尿病モデルを使用して得られました 14,15 が、潜在的な近位尿細管損傷は過小評価されていました 16。以前の研究では、STZ22、23、24の投与後に細胞周期の停止とSGLT2発現の減少が起こることが示されています。他の糖尿病マウスモデルにおけるグルコース再吸収を増加させるための SGLT2 の代償的上方制御に基づくと、STZ 投与後の SGLT2 の下方制御は、潜在的な近位尿細管損傷を示します。

我々の公平なトランスクリプトミクスにより、STZ 処理した尿細管上皮細胞株では p53 シグナル伝達が上方制御されていることが明らかになりました。また、STZ が in vivo および in vitro で用量依存的に p53 のリン酸化を誘導することも見出しました。注目すべきことに、STZ治療後の慢性期における腎臓および肝臓組織におけるp53の上方制御を実証した以前の報告とは異なり、p53はSTZ投与後の急性期の尿細管上皮において上方制御されることが判明した。腫瘍抑制タンパク質である p53 は、DNA 損傷、がん遺伝子発現、低酸素、ROS、栄養欠乏などのストレスに対する細胞応答の重要な要素です 27。リン酸化後、p53 は核に移行し、細胞周期、アポトーシス、オートファジー、代謝に関連する広範囲の遺伝子を転写的に活性化します 27。われわれは尿細管上皮細胞内の DNA 損傷を STZ 用量依存的に検出し、血糖値に関係なく STZ 注射後 1 週間持続することを示した。以前の研究では、尿細管上皮細胞の活性化p53がSTZ誘発性1型糖尿病の表現型として同定されている28が、高血糖ではなくSTZ誘発性のDNA損傷がこれらの表現型に寄与している可能性がある。

シスプラチンと STZ によって in vivo で誘発された DNA 損傷を比較すると、最も顕著な違いは腎臓組織における損傷領域の組織学的分布でした。シスプラチンによって損傷された尿細管領域は、主に、近位尿細管の S3 セグメントが存在する髄質外層の外側のストライプに局在していました 29。対照的に、今回の結果は、STZによる尿細管損傷はその領域ではほとんど検出されないが、近位尿細管のS1およびS2セグメントが存在する外皮質内では顕著に存在することを示した。これは、STZが近位尿細管のS1/2セグメントで主に発現されるGLUT2およびSGLT2を介して細胞に侵入するという我々の理論を裏付けるものである。

STZ誘発尿細管損傷におけるp53シグナル伝達の上方制御に基づいて、p53の薬理学的阻害が可能な予防戦略である。以前の研究では、活性化された p53 シグナル伝達が、シスプラチン腎毒性や虚血再灌流傷害を含むさまざまな疾患モデルにおける腎傷害において重要な役割を果たしていることが実証されました 30,31,32,33,34,35,36。しかし、腎損傷に対する p53 の薬理学的阻害または遺伝子欠失の影響は複雑です 36,37。以前の研究では、p53 の阻害が常に有益であるとは限らず、実際には組織損傷または線維症を悪化させることが実証されました 37,38。損傷モデルの種類と動物種は、腎損傷に対する p53 阻害の応答で観察される差異に寄与している可能性があります 37。 STZ誘発性腎損傷では、ピフィトリンαがDNA損傷を軽減しないことがわかりました。ただし、腎損傷マーカーの発現はわずかに改善されました。したがって、ピフィトリン-αは尿細管上皮細胞によるSTZの取り込みを妨げないようには見えませんでしたが、その後のp53活性化媒介尿細管損傷はある程度軽減されました。

抗がん剤の使用に関連する主な制限要因の 1 つは正常組織における細胞毒性であり、腎臓が最も一般的な標的臓器です 8。血清クレアチニンレベルは、STZ 治療を受けた患者の大部分で増加しませんでしたが、尿中グルコース排泄が不十分であることは、潜在的な近位尿細管損傷を示しています。まとめると、今回の結果と以前の発見は、血糖値が十分に上昇しない一方で、尿中グルコース排泄に寄与する可能性がある STZ 処置マウスにおける SGLT2 発現の顕著な減少を示しました 19,23 。抗がん剤の腎毒性を最小限に抑えるために考えられるアプローチの 1 つは、腎細胞への薬剤の取り込みを減らすことであり、尿細管特異的な遮断が理想的です。以前の発見と一致して、今回の結果は、SGLT2の薬理学的阻害がSTZ19による腎毒性を部分的に阻害する一方、SGLT2を発現しない膵臓β細胞に対する細胞毒性効果は維持されることを示した。したがって、SGLT2 阻害剤による前治療は、腎損傷に対する特異的な予防アプローチとしての可能性を秘めています。

この研究にはいくつかの制限があります。第一に、特に尿細管上皮における膜貫通トランスポーターの発現において、in vivo と in vitro の実験 qPCR 結果の間に矛盾がありました。 1つの説明は、細胞極性の喪失とそれに伴うSGLT2を含む膜輸送体の発現喪失が、培養条件下の尿細管上皮で観察されることがあることである39,40。したがって、これらの分子の in vitro 発現は過小評価されている可能性があります。第二に、p53 の活性化はさまざまな傷害後の DNA 損傷の下流でのシグナル伝達として一般的ですが、NET 患者のヒト腎臓組織では p53 の活性化を示すことができませんでした。最後に、我々はダパグリフロジンが in vivo で尿細管上皮における STZ 誘発 DNA 損傷を改善することを実証したが、その正確なメカニズム、特に STZ が本当に SGLT2 を介して細胞内に侵入するかどうかは直接解明されていない。さらに、STZは双方向性グルコース輸送体であるGLUT2を介して膵臓β細胞に入るが、近位尿細管上皮におけるGLUT2媒介STZ輸送の方向は我々の実験では不明であり、今後さらなる研究が必要である。

結論として、本研究は、インビトロ、インビボ、およびNET患者からの腎生検サンプルにおけるSTZの腎毒性を明らかにした。 STZ 誘発性腎毒性の原因は、DNA 損傷とそれに続く尿細管上皮細胞における p53 の活性化です。 SGLT2 阻害剤は、in vivo で尿細管上皮細胞の DNA 損傷を防止する一方で、膵臓 β 細胞に対する細胞毒性は維持されました。これは、SGLT2 阻害剤による前治療が、NET 患者の腎組織に対する STZ の有害事象に対する魅力的な予防選択肢であることを示唆しています。さらに、STZ 誘発性の腎毒性は実験設定では過小評価されているため、STZ 誘発性 1 型糖尿病における腎損傷を慎重に評価する必要があります。

私たちは、京都府立医科大学で STZ による治療を受けた NET 患者 8 名を遡及的に登録しました。年齢、性別、合併症、検査結果を含むすべての臨床的特徴は医療記録から収集され、補足表 1 にリストされました。ヒト腎臓サンプルは腎生検によって 2 人の患者から採取されました。対照として、尿細管組織ではなく主に糸球体に関与する薄い基底膜疾患を患う患者の腎臓組織を分析しました。患者情報は分析前に匿名化され、匿名化されました。本研究のプロトコル全体はヘルシンキ宣言に従って設計されました。遡及的な設計と患者へのリスクの低さにより、倫理委員会は以下のオプトアウト方法論の使用を承認しました。口頭によるインフォームド・コンセントの要件は免除され、一般にアクセス可能な情報と簡単なオプトアウト・モードによってインフォームド・コンセントが取得されました。本研究は京都府立医科大学附属病院医倫理委員会の承認を受けた（承認番号：ERB-C-2169、ERB-C-2210）。

雄の C57BL/6 野生型マウスを清水株式会社 (京都、日本) から購入しました。 STZ損傷モデルは、0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中のSTZ（Cayman Chemical、ミシガン州、米国）を100、150、または200 mg/kg体重の濃度で同年齢の雄マウスに腹腔内注射することによって誘導されました。 8～10週間。 STZ注射の1日または7日後にマウスを安楽死させた。同腹子対照マウスを群間の比較に使用した。すべてのインスリン治療群にインスリングラルギン（和光市、大阪府）を皮下注射し、空腹時血糖値を同じレベルに維持する量（±インスリングラルギン 2～6 単位/kg）に調整しました。

インビボで p53 を阻害するために、前述のように STZ 注射の直前に 2.2 mg/kg のピフィトリン-α (ab120478、Abcam plc.、ケンブリッジ、英国) を腹腔内注射しました 41。インビボでＳＧＬＴ２を阻害するために、１．０ｍｇ／ｋｇのダパグリフロジン（ＳｅｌｌｅｃｋＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．、米国ヒューストン）を７５％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）で溶解および希釈し、ＳＴＺ処置の１時間前に強制経口投与した。体重と血糖値は、8時間の絶食後の17:00に測定されました。血糖値は、グルコメーター（Glutest Every、三和化学研究所株式会社、愛知県）を使用して測定した。マウスをイソフルランで麻酔し、指定の時点で安楽死させ、その後、下大静脈から血液サンプルを採取した。腎臓と膵臓はさらなる分析のためにサンプルに切断されました。

すべての実験は、京都府立医科大学実験動物委員会の承認を受け、施設のガイドライン、日本学術会議による動物実験の適正な実施に関するガイドライン、およびARRIVEガイドラインに従って実施されました。

正常なラット腎臓上皮細胞 (NRK 52E 細胞) は JCRB Cell Bank から入手しました。細胞は、1% ペニシリンおよびストレプトマイシン (Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド) および 5% FBS (Invitrogen) を含む DMEM (Wako、大阪、日本) 中で、加湿 5% CO2 および 95% 空気雰囲気下、37 °C で培養されました。細胞を、細胞計数の前に、ジメチルスルホキシドに溶解した1、5、10、または30 mMのSTZで24時間処理しました。細胞数は、死細胞染色のヨウ化プロピジウム染色法を利用して機能するADAM-MC自動セルカウンター（デジタルバイオ、日本）を用いて計測した。

血清血中尿素窒素（BUN）は、適切な酵素法（A667-00、Serotec、北海道、日本）を使用して測定されました。採取した血漿中のインスリン濃度は、超高感度マウスインスリン ELISA キット (森永生物科学研究所、金沢、日本) を製造者の指示に従って使用して測定しました。

マウスを麻酔して屠殺し、指示された時点で膵臓と腎臓を摘出しました。パラフィン切片を調製するために、応用医学研究所（大阪、日本）により、膵臓と腎臓を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋しました。パラフィン包埋したマウスおよびヒトの組織を厚さ 4 μm の切片に切断しました。過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色は、標準的な手順に従って実行されました。

脱パラフィン後、マウスおよびヒトのパラフィン切片をクエン酸緩衝液 (pH 6.0) に入れ、5 分間煮沸して抗原を回収しました。内因性ペルオキシダーゼをメタノール中の3.0%過酸化水素で20分間クエンチした。サンプルを室温で 30 分間、PBS 中の 3% BSA でブロックし、一次抗体とインキュベートしました (補足表 2)。切片をヤギ抗ウサギ HRP 結合二次抗体 (ab236469、Abcam) で標識しました。ジアミノベンジジン発色基質 (K3468、Agilent Technologies, Inc.、カリフォルニア州サンタクララ) を呈色反応に使用し、続いてヘマトキシリンで対比染色しました。すべての切片は、Eclipse E600 顕微鏡 (Nikon、東京、日本) および BZ-X700/BZ-X710 顕微鏡 (Keyence Corporation、大阪、日本) を使用して観察されました。 γH2AX 陽性細胞は、各腎臓の重複しない連続した皮質領域および髄質領域 10 個のうち 3 個から高倍率で定量されました (n = 3)。これら 3 つのフィールドは、盲検法でランダムに選択されました。

免疫蛍光染色の場合、凍結切片を再水和し、PBS中の0.5% Triton X-100で5分間透過処理しました。サンプルを PBS 中の 3% BSA でブロックし、補足表 2 に示す一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートし、続いて Alexa Fluor 594 結合二次抗体 (補足表 2) とともに 1 時間インキュベートしました。核の対比染色は、DAPI または DRAQ5 (DR50050; BioStatus、レスターシャー、英国; 1:2000) を使用して実行し、続いて Prolong-Gold (Thermo Fisher Scientific) にマウントしました。画像は共焦点顕微鏡 (FV1000; オリンパス、東京、日本) によって取得されました。

TRIzol (Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド) および Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research、カリフォルニア州アーバイン) を使用して、腎臓の皮質または NRK-52E 細胞から全 RNA を抽出しました。 gDNA Eraser (Takara Bio) を備えた PrimeScript RT 試薬キットを使用して、200 ナノグラムの全 RNA を逆転写して cDNA を合成しました。 PCR産物のリアルタイム検出は、KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (Kapa Biosystems、Wilmington、MA) およびThermal Cycle Dice Real Time System (Takara Bio Inc.) を使用して実行されました。遺伝子発現は、内部対照としてβ-アクチンを使用して定量化されました。プライマーを補足表 3に示します。

STZ群のラット近位尿細管上皮細胞株であるNRK52E細胞を、RNA抽出前に10mMのSTZで24時間処理した。 RNA サンプルは、ライブラリー構築と配列決定のために、大阪大学微生物病研究所ゲノム情報研究センター NGS 中核施設に提供されました。ライブラリーの調製は、TruSeq 鎖 mRNA サンプル調製キット (Illumina、San Diego、CA) を製造業者の指示に従って使用して実行しました。配列決定は、Illumina HiSeq 2500 プラットフォーム上で 100 bp シングルエンドモードで実行されました。配列決定されたリードは、STAR v 2.7.10a (https://github.com/alexdobin/STAR/) を使用してラット参照ゲノム配列 (Rnor6) にマッピングされ、一意にマッピングされたリードは Subread パッケージ (https:/) の featureCounts 関数によってカウントされました。 /subread.sourceforge.net)。

データ分析は、R ソフトウェアバージョン 4.1.2 (https://www.R-project.org/) を使用して実行されました。発現差解析にはedgeRパッケージを使用しました42。 FDR < 0.05 および絶対 log2 倍率変化 > 1 の遺伝子は、有意に差次的に発現される遺伝子であるとみなされました。 fgsea パッケージは遺伝子セット濃縮分析に使用されました。京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) パスウェイ解析 (https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) は、iDEP バージョン 0.93 (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep93/) を使用して実行されました。一般に適用可能な経路解析用遺伝子セット濃縮（GAGE）法43。

全細胞または組織抽出物は、溶解バッファー 17 (R&D Systems, Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を使用して得られました。タンパク質を95℃で5分間加熱することにより変性させ、SDS-PAGEにより分離した。次に、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜 (Immobileon-P IPVH00010: Millipore、MA、USA) に転写しました。 5％無脂肪乳またはTBS/0.1％Tween20中の3％BSAで室温で1時間ブロッキングした後、膜を一次抗体（補足表2）とともに4℃で一晩インキュベートしました。 TBS/0.1% Tween20で洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を添加した(7074S; Cell Signaling Technology、ボストン、マサチューセッツ州; 室温で1:3000)。化学発光は、ECL セレクトウェスタンブロット検出試薬 (RPN2235: GE Healthcare UK Ltd、Amersham Place、England) または Clarity Max ウェスタン ECL 基質 (1,705,062: Bio-Rad Laboratories, Inc.、Hercules、CA、USA) を使用して検出しました。シグナル強度は、ImageJ ソフトウェア (国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州) を使用して評価しました。

コメットアッセイは、前述のようにコメットアッセイキット (Abcam ab238544) を使用して実行されました 41,44。簡単に説明すると、マウスの腎臓を取り出し、20 mM EDTA を含む少量の氷冷 PBS 中で切り刻みました。上清を35μmのセルストレーナーに通した。遠心分離後、ペレットを氷冷 PBS に 1 × 105 細胞/ml で懸濁しました。サンプルをコメットアガロースと 1/10 の比率 (v/v) で混合し、コメットアガロースのベース層で覆われたスライドガラスに移しました。事前に冷却した溶解バッファーとインキュベートした後、スライドを電気泳動に供しました。電気泳動は、アルカリ彗星アッセイの場合はアルカリ電気泳動溶液で、中性彗星アッセイの場合は TBE 電気泳動溶液で実行されました。電気泳動後、スライドを Vista Green DNA 色素とともにインキュベートしました。画像は、FITC フィルターを使用した落射蛍光顕微鏡 (IX71; オリンパス、東京、日本) によって取得されました。 10 枚の写真 (写真あたり 5 ～ 15 細胞) をランダムに撮影し、Comet Score 解析ソフトウェア (TriTek Corp.) を使用して、グループあたり 100 個の細胞のテールモーメント (テールの長さ × テール % DNA/100) を計算しました。

結果は平均値±標準誤差 (SE) として表されます。統計分析は、2 つの変数の比較および分散分析については対応のない t 検定、および複数の変数の比較についてはダネットの事後検定によって実行されました。 < 0.05 の P 値は有意であるとみなされました。

すべてのサンプルの RNA-seq データは、受託番号 GSE215337 で Gene Expression Omnibus に寄託されました。レビューアーアクセス用の安全なトークン: gzanqiemjhyhdyl。

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〒602-8566 京都市上京区梶井町465 京都府立医科大学大学院医科学研究科腎臓内科学

Kunihiro Nakai, Minato Umehara, Atsushi Minamida, Hiroko Yamauchi-Sawada, Yasuto Sunahara, Yayoi Matoba, Natsuko Okuno-Ozeki, Itaru Nakamura, Tomohiro Nakata, Aya Yagi-Tomita, Noriko Uehara-Watanabe, Tomoharu Ida, Noriyuki Yamashita, Michitsugu Kamezaki, Yuhei Kirita, Keiichi Tamagaki & Tetsuro Kusaba

京都府立医科大学大学院医科学研究科病理学教室

Eiichi Konishi

京都府立医科大学大学院医科学研究科消化器・肝臓内科学

Hiroaki Yasuda

京都府立医科大学大学院医学研究科循環器内科学分野

的場里明

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NK と TK は研究を設計し、実験を実行し、データを分析し、原稿を書きました。 YKはデータを分析しました。 MU、AM、HY-S.、YS、YM、NO-O.、IN、TN、AY-T.、NU-W.、TI、NY、MK、EK、HY、SM、KT がディスカッションに貢献しました。。

Correspondence to Tetsuro Kusaba.

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転載と許可

中井和也、梅原正人、南田明他ストレプトゾトシンは、p53 シグナル伝達の活性化を通じて腎近位尿細管損傷を誘発します。 Sci Rep 13、8705 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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受信日: 2022 年 11 月 24 日

受理日: 2023 年 5 月 24 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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ストレプトゾトシンはp53シグナル伝達の活性化を介して腎近位尿細管損傷を誘発する